ЭНДОТОКСИН (ЛПС) В ПАТОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОЗА =

Конев Ю.В., Лазебник Л.Б.

ГУЗ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы

Конев Юрий Владимирович 111123, Москва, шоссе Энтузиастов, д. 86 E-mail: gastroen ter@rambler. ru

Современные данные о процессах лежащих в основе атерогенеза свидетельствуют о значительной роли эндотоксина (липополисахарида - ЛПС) кишечной микрофлоры в развитии сосудистых поражений. В работе обобщены материалы литературы и результаты собственных исследований об участии ЛПС грамнегативных бактерий в инициировании и прогрессировании атеросклероза. Доказано, что ЛПС грамотрицательных бактерий взаимодействуют TLR4, запускает цитокиновый каскад с последующим формированием атером.

Ключевые слова: эндотоксин; ЛПС; атеросклероз; атерогенез; TLR. SUMMARY

Recent data on the processes underlying atherogenesis indicate the significant role of endotoxin (lipopolysaccharide - LPS) of the intestinal microflora in the development of vascular lesions. This paper summarizes the literature and material results of their research on the participation of LPS gramnegativnyh bacteria in the initiation and progression of atherosclerosis. We prove that the LPS of gram-negative bacteria interact with TLR4, triggers cytokine cascade with the subsequent formation of atheroma. Keywords: endotoxin; LPS; atherosclerosis; aterogenesis; TLR.

В настоящее время количество умирающих от атеросклероза значительно превышает количество летальных исходов от других заболеваний. Ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, ишемические поражения головного мозга, хроническая ишемия нижних конечностей, хроническая ишемическая болезнь органов пищеварения - вот далеко не полный перечень тяжелых заболеваний, в основе которых лежат атеросклеро-тические поражения сосудистой стенки. Патогенез атеросклероза сложен и многообразен, а в процессе инволюции частота и интенсивность факторов риска резко возрастают, что и определяет высокую заболеваемость атеросклерозом людей старших возрастных групп. Однако некоторые общебиологические механизмы лежащие в основе возникновения атеросклеротического процесса, недостаточно изучены .

Наиболее широко распространено в настоящее время положение о том, что атеросклероз является хроническим заболеванием, в основе которого лежат повреждения эндотелия и формирование в стенке артерий фиброзных атеросклеротических бляшек,

до настоящего времени, несмотря на предложенные варианты, остается недостаточно ясной причина, запускающая механизм образования атероскле-ротической бляшки. Исследования последних лет заставляют предположить возможность участия в этих процессах эндотоксина, избыточному образованию которого способствуют дисбиотические изменения в кишечнике, столь нередко возникающие в пожилом и старческом возрасте .

Эндотоксин - липополисахарид (ЛПС), входящий в состав внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, обладающий широким спектром различных видов биологической активности.

В норме из толстого кишечника человека в кровоток проникает лишь незначительное количество ЛПС, так как у человека имеется ряд гуморальных и клеточных факторов, связывающих ЛПС: липо-протеины высокой удельной плотности, антитела, в частности антитела к гликолипиду хемотипа Re, клетки Купффера, полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги. Еще недавно считалось, что в физиологических условиях ЛПС проникает из кишечника

лишь в воротную вену, где захватывается в основном клетками Купффера, однако исследования последних лет показали, что эндотоксин в небольших количествах обнаруживается у здоровых людей и даже у новорожденных детей в системном кровотоке, в плазме крови и на поверхности полиморфоядерных лейкоцитов. Нормально функционирующие анти-эндотоксиновые факторы обеспечивают достаточно эффективную защиту организма от вредных последствий действия ЛПС в физиологических условиях. Однако ситуация существенно изменяется при стрессе, действии проникающей радиации и других экологически вредных факторов, различных заболеваниях инфекционного и неинфекционного генеза. В этих условиях не только увеличивается проникновение ЛПС в системный кровоток, но и истощаются факторы антиэндотоксинового иммунитета. При этом резко снижаются титры антител к гликолипиду хемотипа Re, нейтрализующих эндотоксин, содержание ПЯЛ, связывающих ЛПС in vivo, в кровотоке. Также практически исчезают ПЯЛ, способные связывать ЛПС in vitro. Иными словами, исчезают резервы связывания ЛПС антителами и гранулоцитами и организм становится почти полностью беззащитным к повторным атакам вновь поступающего в кровь ЛПС .

Первичные или начальные этапы системного воздействия эндотоксина обусловлены взаимодействием ЛПС с различными клетками крови и тканей, а также липопротеинами крови. Из клеток, акцептирующих эндотоксин, главными участниками и индукторами воздействия эндотоксина являются эндотелиальные клетки, тромбоциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, тучные клетки, гепатоциты, что свидетельствует об отсутствии селективного связывания эндотоксина клетками.

Следует отметить, что значительная часть эндотоксина транспортируется к органам и тканям в комплексе с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП), а фиксация эндотоксина на различных клетках крови, мезенхимы и органоспецифических элементах обусловлена в значительной мере наличием на их мембране рецепторов образраспознающих рецепторов (ОРР) Toll-подобного типа (TLR) .

Активная клеточная акцепция ЛПС в организме объясняет феномен диссоциации между явлениями умеренного содержания ЛПС и «эндотоксиновой аггрессией», когда при невысоком содержании в крови циркулирующего эндотоксина развивается характерная картина эндотоксинового каскада вплоть до шока.

Элиминация эндотоксина из системного кровотока носит двухфазный характер: вслед за быстрой адсорбцией ЛПС на клетках крови возникает его депонирование преимущественно в печени и в значительно меньших концентрациях в селезенке, кишечнике, легких, почках с последующим их повреждением при участии цитокинов.

В ранний период «эндотоксиновой агрессии» установлено повышение образования острофазных

белков: С-реактивного белка, трансферрина, кислого-а1-гликопротеина, гаптоглобина, ИЛ-6, коррелирующее с выраженностью степени эндо-токсинемии. И, конечно же, белки острой фазы принимают активное участие в связывании и инактивации избыточного эндотоксина.

Элиминация эндотоксина из системного кровотока обеспечивается наличием антител к детерминантам ядра ЛПС, а также ингибиторов неимму-ноглобулиновой природы. Отмечен выраженный детоксикационный эффект больших доз гепарина, активирующего липопротеиновую липазу, которая в свою очередь разрушает ЛПС.

Имеются сообщения об участии в процессах детоксикации ЛПС в крови лизоцима, интерферона, макроглобулинов, термолабильного сывороточного инактиватора с эстеразной активностью, фосфатаз, комплемента, белка а-глобулиновой фракции крови с константой седиментации 4,5 .

Определенную роль в эндотоксинсвязывающей активности плазмы крови играют липопротеиды высокой удельной плотности, способные образовывать с ЛПС устойчивый комплекс.

Детоксикация и деградация ЛПС в клетках осуществляются при участии различных ферментативных систем: липоксигеназ, фосфорилаз, деацетилаз, дефосфорилаз.

Тем не менее известно что главными акцептирующими ЛПС клетками крови являются полиморф-ноядерные лейкоциты (ПЯЛ), макрофаги, тромбоциты. Установлено, что уже через 1-2 минуты после введения эндотоксина около 40% ПЯЛ содержат на своей поверхности эндотоксин, к 30-й минуте эндотоксинсодержащие ПЯЛ секвестируются в микроциркуляторном русле легких, печени, почек, селезенки и в меньшей степени в надпочечниках, инициируя повреждение этих органов. Установлено, что эндотоксинстимулированная секвестрация ней-трофилов в легких не связана с усилением продукции ФАТ и тромбоксана А2, а обусловлена усилением продукции L-селектина.

Через 30-60 минут после введения эндотоксина Sl. typhi murium кроликам отмечалось уменьшение активности миелопероксидазы и уровня катионных белков в ПЯЛ, достигающее максимума к 3 часам.

Опосредованно, через усиление продукции фибро-нектина, сальмонеллезный эндотоксин увеличивает хемотаксическую, адгезивную активность нейтрофи-лов, усиливает пониженную и уменьшает повышенную генерацию ПЯЛ супероксидного аниона радикала.

Сложное динамическое взаимодействие эндо-токсинсвязывающих систем крови и эндотоксина обуславливает интенсивность развития изменений реологических свойств крови, гемостаза и микроциркуляции при системной эндотоксинемии.

Связывание эндотоксина макрофагами, ПЯЛ, с одной стороны, индуцирует развитие комплекса защитных реакций, а с другой - продукцию ци-токинов и цитокинопосредованную деструкцию различных органов и тканей .

Таким образом, например, эндотоксин (ЛПС) - компонент внешней оболочки грамотрицательных бактерий - взаимодействует с ЛПС-связывающим протеином (LBP) и транспортируется в печень. Макрофаги печени (звездчатые ретикулоциты) и моноциты активируются и высвобождают воспалительные медиаторы. Это служит предпосылкой развития синдрома системного воспалительного ответа (ССВО).

ЛПС может способствовать развитию нарушений функций кишечного барьера посредством следующего механизма. ЛПС в высоких концентрациях непосредственно активирует CD14 клетки эндотелия кишечника, в результате чего теряется целостность эндотелия.

Важную роль в атерогенезе играет хронический воспалительный процесс, который обусловливает развитие альтерации и пролиферации эндоте-лиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки и активацию макрофагов, локализованных в интиме артерий. Активированные макрофаги в избыточном количестве поглощают холестерин из липопротеинов низкой удельной плотности и превращаются вследствие этого в пенистые клетки, появление которых является одним из ранних признаков формирования атером .

Один из механизмов действия эндотоксина реализуется через дисфункцию эндотелия. В частности, эндотелиальную дисфункцию следует назвать главной причиной смерти пациентов через несколько лет после перенесенного перитонита.

Независимо от причины ведущими звеньями патогенеза эндотелиальной дисфункции при различной патологии являются дисбиоз, избыточное поступление эндотоксинов в портальный и системный кровоток, нарушение метаболических функций печени и системная воспалительная реакция. Они образуют замкнутую патологическую систему, главной мишенью которой становится эндотелий, в том числе синусоидов ретику-лоэндотелиальной системы печени.

Рис. 1. Патогенез повреждения сосудистой стенки при эндотоксиновой агрессии

клеточными рецепторами CD14, расположенными на мембранах макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов, эндотелиоцитов, активирует их, стимулируя выработку этими клетками цитокинов и других медиаторов воспалительной реакции - комплемента, вазоактивных медиаторов, метаболитов арахидоновой кислоты, адгезинов, кининов, факторов активации тромбоцитов, гистамина, эндотели-нов, факторов коагуляции, активных кислородных радикалов и оксида азота (NO). Этот медиатор наделен главными патологическими полномочиями при формировании эндотелиальной дисфункции в любых ситуациях.

Синтезированный NO оказывает как аутокрин-ное, так и паракринное действие, то есть влияет на метаболические процессы как в самих клетках, так и в расположенных по соседству. Клеточными мишенями NO являются железосодержащие ферменты и белки (гуанилатциклаза, NO-синтетаза, митохон-дриальные дыхательные ферменты, ферменты цикла Кребса, ферменты синтеза белка и ДНК); белковые SH-группы и др. Связываясь с кислородом, NO образует чрезвычайно токсичные соединения - пероксинитриты. Образование NO и L-циррулина катализируется ферментом синтетазой (NOS) из L-аргинина. Известны три типа NOS: нейрональная (nNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная (iNOS). В физиологических условиях синтез NO обеспечивают nNOS и eNOS синтетазы, а синтез iNOS увеличивается только в ответ на действие патогенных стимулов: экспрессию гена iNOS индуцируют ИЛ-1, интерферон-у, ФНО-а и эндотоксин грамнега-тивных бактерий. В физиологических условиях эти

механизмы с участием N0 используются макрофагами для уничтожения опухолевых клеток, которые не только сами производят N0, но и секретируют ФНО-а, индуцируя тем самым синтез в них iN0S. Помимо проапоптической роли, активация iN0S важна для поддержания иммунитета при остром и хроническом воспалении.

Ограничение патологического действия N0 и его инактивация осуществляются с помощью суперок-сидрадикала О2 увеличение продукции которого в кровеносной системе фагоцитирующими или эндо-телиальными клетками в то же время провоцирует спазм и является основой развития последующей ЭД. Аналогичным действием обладают окисленные и гликозилированные формы липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), они ингибируют еN0S в макрофагах и эндотелиоцитах .

Однако механизмы повреждающего действия эндотоксина на клетки эндотелия явны недостаточны. Конечно, это действие опосредуется через полиморфноядерные лейкоциты. В настоящее время известны несколько видов взаимодействия ЛПС с ПЯЛ и макрофагами: а) ЛПС связывается с рецеп-торным белком СD18, причем такое связывание не является необходимым для активации лейкоцитов;

б) ЛПС связывается сначала с белком LBP плазмы, а затем в комплексе с этим белком реагирует с рецептором СD14, что ведет к активации лейкоцитов;

в) неспецифическое взаимодействие ЛПС с мембранами клеток. К этому следует добавить также описанное Fc-зависимое связывание ЛПС клетками, армированными антиэндотоксиновыми антителами. Вклад этих видов связывания в проективную и

патогенетическую роли гранулоцитов пока еще не изучен. По-видимому, исход взаимодействия ЛПС с лейкоцитами и свойства ПЯЛ, индуцированные ЛПС, зависят от концентрации эндотоксина: при относительно низких концентрациях имеет место активация и положительный (физиологический) эффект, при высоких концентрациях - гиперактивация, перегрузка лейкоцитов эндотоксином и патологический эффект (развитие органопатологии). При гиперактивации лейкоцитов и их разрушении в окружающую среду выбрасывается много ферментов, в частности, эластаза и другие лизосомальные ферменты, которые могут оказывать повреждающее действие на клетки эндотелия .

Проведенные нами исследования позволили установить тот факт, что в крови лиц старших возрастных групп содержатся достаточно высокие титры антигликолипидных антител. Тот факт, что с увеличением возраста титр антител практически не изменялся, позволяет утверждать, что в инволюционном возрасте сохраняется синтез собственных антител к эндотоксину, что также косвенно подтверждает универсальное действие эндотоксина на организм человека.

Кроме этого, у пожилых с явлениями атеросклероза нами был обнаружен феномен ослабленности гранулоцитарного звена антиэндотоксиновой защиты. При исследовании в мазках крови с помощью ЛПС-теста выявлено практически полное отсутствие не только резервов связывания эндотоксина грану-лоцитами, но и также недостаточное значение или полное отсутствие ЛПС-позитивных лейкоцитов в крови. Связывание эндотоксина гранулоцитами является очень важным звеном антиэндотоксиновой защиты и ЛПС-элиминирующей функции. Кроме того, акцепция эндотоксина гранулоцитами обусловливает активацию антимикробного потенциала этих клеток и является важным звеном общей антибактериальной резистентности организма в целом. Снижение нативных ЛПС-позитивных ПЯЛ в системном кровотоке лиц старших возрастных групп, по-видимому, является следствием определенной возрастной неполноценности этой популяции клеток, которые, как известно, выполняют функции первого антибактериального барьера. Наверное, именно этим обстоятельством объясняется подверженность организма лиц старших возрастных групп к неблагоприятному течению осложнений атеросклероза, в особенности бактериальных инфекций.

Снижение ЛПС-позитивных гранулоцитов в общем кровотоке лиц старших возрастных групп при наличии достаточно высоких титров антигли-колипидных антител свидетельствует, на наш взгляд, и о некоторой неспособности ПЯЛ у лиц старшего и пожилого возраста к Fc-связыванию вообще (то есть и иных антигенов), что, безусловно, свидетельствует об определенной возрастной «дефектности» системы полиморфноядерных лейкоцитов у лиц инволюционного периода.

Под действием избытка эндотоксина в лейкоцитах активируются и ферменты пе-рекисного окисления липидов, конечные продукты которого также могут вызывать повреждения эндотелия.

В действие эндотоксина на эндотелий может вовлекаться также система комплемента, которая активируется эндотоксином. В частности, с ЛПС взаимодействует фракция комплемента С5а.

Наконец, возможен еще один механизм действия эндотоксина на эндотелий. На поверхности клеток эндотелия находится фи-бронектин, который играет важную роль во взаимодействии клетка-клетка и в прикреплении клетки к подслою. Фибронектин плазмы антигенно идентичен фибронектину на поверхности клеток и также участвует в прикреплении клеток друг к другу и к ба-зальной мембране. При эндотоксинемии фибронектин плазмы может разрушаться лейкоцитарными протеазами и расходоваться в качестве опсонина, что может приводить к его вымыванию с поверхности клеток эндотелия и их слущиванию. После введения эндотоксина клетки эндотелия обнаруживаются в кровотоке у 88% подопытных животных, тогда как до введения они обнаруживались лишь у 12% здоровых животных.

Предположение о возможной роли ЛПС в патогенезе атеросклероза нашло свое подтверждение в ходе проведенного в последние годы и продолжающегося в настоящее время интенсивного накопления и изучения материалов о роли образраспознающих рецепторов (ОРР) в механизмах врожденного иммунитета. Понятие об ОРР было впервые предложено С.А. Janewаy. В настоящее время известно несколько семейств ОРР. Практически все ОРР являются сигнальными, они распознают главным образом чужеродные компоненты (лиганды), оповещают об их приходе и запускают каскад реакций, обеспечивающих передачу сигнала к ядру клетки и начало синтеза целого ряда биоактивных молекул. Сейчас наиболее полно изучены То11-подобные рецепторы (TLR). Они обнаружены на клетках эпителия, эндотелия, на моноцитах и макрофагах, полиморфноядерных лейкоцитах, дендритных и других клетках, вступающих в контакт с чужеродными агентами. У человека известны 10 TLR. Рецепторы TLR 1, 2, 4, 5, 6 и 10, распознающие поверхностные компоненты микроорганизмов, локализуются на поверхности клеток, а рецепторы TLR 3, 7, 8 и 9, связывающие структуры вирусных и бактериальных нуклеиновых кислот, размещаются в эндоплазматическом ретикулуме .

TLR играют очень важную роль в физиологии макроорганизма (рис. 2). После взаимодействия с микробными или вирусными лигандами они обусловливают синтез провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, дефенсинов, стимулируют реакции врожденного и адаптивного

Рис. 2. Виды TLR-рецепторов (Akira и соавт., 2003)

иммунитета, обеспечивают участие кишечной микрофлоры в поддержании гомеостаза и репарации повреждений клеток эпителия слизистой оболочки. Исследователи из США по результатам проведенных недавно экспериментов сделали заключение о том, что рецепторы TLR имеют по крайней мере две функции: 1) защита от инфекции и 2) поддержание тканевого гомеостаза.

Имеется достаточно четко выраженная специфичность реакций ^В. с различными структурами. Так, играет важную роль в ответе клеток макроорганизма на ЛПС грамотрицательных бактерий, Кроме того, он распознает белок теплового шока р60, пептиды фибронектина и некоторые другие компоненты. образует димеры с и и распознает пептидогликан грамположительных бактерий, липотейхоевую кислоту, зимозан, диа-циловый липопептид, белок теплового шока р70 и другие структуры. связывает флагеллины

грамположительных и грамотрицательных бактерий. Рецепторы ^В3, 7, 8, 9 распознают бактериальную и вирусную ДНК, вирусную двунитевую РНК и некоторые неметилированные дезоксиоли-гонуклеотидные последовательности.

Такая специфичность реакций ^В позволила определить их функции и роль в патогенезе некоторых патологических процессов. Так, при мутации в гене 1:1г4, который кодирует синтез рецептора ^В4, отменяется ответ на ЛПС, резко возрастает чувствительность к инфекциям, вызванным гра-мотрицательными бактериями, но снижается риск развития атеросклероза и инфаркта миокарда. При этом наблюдается также снижение концентрации циркулирующих провоспалительных цитокинов, фибриногена и растворимых адгезинов, вовлекаемых в формирование атеросклеротических бляшек на стенках сосудов и прогрессирование атеросклероза. Следовательно, получены доказательства важной роли ТЬВ4 в патогенезе атеросклероза, а также значимости ЛПС, одного из основных лигандов как причинного фактора,

запускающего реакции, способные в итоге вызвать

формирование атеросклеротических поражений сосудистой стенки .

Публикация о роли хламидийного ЛПС в инициировании атерогенеза появилась еще в 1998 году, однако сообщения о возможной роли бактериальных ЛПС в инициировании атеросклеротических повреждений появились значительно раньше. В частности, было показано, что ЛПС вызывает повреждения эндотелия у экспериментальных животных. Было установлено также, что ЛПС E. coli и S. typhimurium индуцируют накопление липидов в макрофагах при их культивировании в присутствии нативных липопротеинов низкой удельной плотности. Эти материалы позволили высказать предположение о связи между эндотоксинемией и атеросклерозом. Появились также первые клинические материалы, подтверждающие это предположение. Наблюдения в течение длительного времени за довольно большим количеством пациентов с ишемической болезнью сердца показали, что инфаркт миокарда развивался в несколько раз чаще у больных с высоким содержанием эндотоксина в кровотоке. В высоких концентрациях эндотоксин обнаруживался также в кровотоке больных хронической ишемией нижних конечностей, причем тяжесть клинического течения заболевания коррелировала с концентрацией эндотоксина в крови .

С 1992 года после исследования BONE оформилось понятие синдрома системного воспалительного ответа (ССВО). Еще в высказываниях И.И. Мечникова указывалось на воспаление, особенно его сосудистый компонент, как на универсальную защитную реакцию. В то же время И.И. Мечников отмечал возможность не только защитного эффекта от воспалительного синдрома, но и от повреждающего влияния на органы и системы больного. В настоящее время показано, что ССВО возникает не только при всех экстремальных состояниях - политравме, тяжелых инфекциях, сгисЬ-синдроме, тяжелой гипертонии, панкреатите, тяжелых операциях и др. Детали синдрома системной воспалительной реакции стали более понятны после определения

цитокинов и выявления их функции. К настоящему времени известны этапы развития синдрома системного воспалительного ответа и полиорганной недостаточности, которые в значительной степени определяются эндотоксином .

Исход реакции ЛПС с клетками макроорганизма зависит от его концентрации (рис. 3). Умеренная активация клеток и систем при низких дозах эндотоксина приводит к развитию ССВО, проявляющемуся локальным повреждением тканей. С увеличением дозы до умерено повышенного уровня эндотоксина начинают проявляться системные реакции в виде острофазного ответа и лихорадки. И наконец высокий уровень ЛПС приводит к гиперактивации, которая сопровождается усиленной продукцией туморнекротизирующего фактора-а и ряда других медиаторов, усиленной активацией системы комплемента и факторов свертывания крови, что может заканчиваться развитием таких грозных осложнений, как диссеминированное внутрисосу-дистое свертывание (ДВС), эндотоксиновый шок и острая полиорганная недостаточность.

В зависимости от дозы ЛПС вызывает повреждения клеток или стимулирует синтез ряда физиологически активных медиаторов, таких как эндогенный пироген, интерлейкины, туморнекротизирующий фактор и другие.

Изучено влияние синдрома системного воспалительного ответа на гемостаз, развитие тромбофи-лического состояния. Однако проявления синдрома системного воспалительного ответа применительно к различным медицинским направлениям изучены недостаточно. В лечебной тактике пока не получили отражения в достаточной мере патофизиологические изменения, происходящие в процессе ССВО.

Исследования последних лет доказали, что кишечник играет центральную роль в патогенезе развития синдрома системного воспалительного ответа - SIRS (ССВО) и его крайнего проявления - полиорганной недостаточности. Кишечник не просто орган, отвечающий за обеспечение организма необходимыми питательными веществами. Для сохранения целостности слизистой самого кишечника необходимо наличие питательных веществ. Кишечник выполняет эндокринную, иммунную, метаболическую и механическую барьерные функции. Многие факторы участвуют в поддержании целостности и регенерации слизистого слоя желудочно-кишечного тракта. Это желудочно-кишечные пептиды, энтероглюкагон, тироксин, жирные кислоты, гормон роста, пейеровы бляшки, лимфоциты, макрофаги, иммуноглобулин А в желчном секрете. Стенка кишечника богато выполнена лимфоидной тканью, которая взаимодействует с бактериальной флорой кишечника и факторами питания; в норме бактерии и токсины из просвета кишечника в небольшом количестве проникают через систему портальной вены в печень, где осуществляется их клиренс купфферовскими и ретикулоэндотелиаль-ными клетками. Нормальная микрофлора, являясь симбионтной, выполняет ряд функций, существенно важных для макроорганизма. Это и неспецифическая защита от бактерий, вызывающих кишечные инфекции, основанная на микробном антагонизме, и участие в выработке антител, и витаминосин-тезирующая функция микроорганизмов, в частности, витаминов С, К, В, В2, В6, В, РР, фолиевой и

Рис. З.Эндотоксин и воспаление

пантотеновой кислот. Кроме того, микробы, населяющие кишечник, расщепляют целлюлозу, участвуют в ферментативном расщеплении белков, жиров и высокомолекулярных углеводов, способствуют всасыванию кальция, железа, витамина D, благодаря созданию кислой среды принимают участие в обмене желчных кислот и образовании в толстой кишке стеркобилина, копростерина, дезоксихоле-вой кислоты, участвуют в образовании продуктов распада белка (фенола, индола, скатола), нормализующих кишечную перистальтику. Нормальная бактериальная микрофлора способствует «созреванию» макрофагально-гистиоцитарной системы, влияет на структуру и всасывающую способность слизистой оболочки кишечника .

Микрофлору кишечника подразделяют на об-лигатную, факультативную, транзиторную.

Облигатная часть микрофлоры постоянно входит в состав нормальной флоры и определяет ряд метаболических процессов, осуществляет защиту организма хозяина от инфекции. Факультативная часть, встречающаяся у здоровых людей при снижении резистентности микроорганизма, может выступать в качестве этиологического фактора заболевания. Транзиторная часть обнаруживается, как правило, случайно, так как неспособна к длительному пребыванию в макроорганизме.

Нередко возникают трудности в трактовке результатов бактериологического исследования кала в связи с широкими колебаниями их даже у практически здоровых людей, быстрой сменяемостью показателей у одного и того же больного при повторных исследованиях без какой-либо закономерности. К тому же известно, что микрофлора фекалий не всегда отражает содержание пристеночной, криптовой и, вероятно, даже внутрипросветной (полостной) микрофлоры кишечника .

Слизистая кишечника постоянно обновляется, имеет высокую степень метаболической активности и, таким образом, является более уязвимой для ишемии и атрофии. Если эпителиоциты лишены номинального притока питательных веществ, то имеет место снижение активности репродукции и миграции клеток, а также синтеза ДНК и барьерной функции кишечника.

Учитывая это, в норме из просвета кишечника в кровоток проникает лишь небольшое количество ЛПС, так как у человека имеется ряд гуморальных и клеточных факторов, связывающих ЛПС: липо-протеины высокой удельной плотности, антитела, в частности антитела к гликолипиду хемотипа Яе, клетки Купффера, полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги. Антиэндотоксиновые факторы обеспечивают достаточно эффективную защиту организма от избытка ЛПС в физиологических условиях. Однако ситуация существенно изменяется при неблагоприятных экологических условиях и при различных заболеваниях, что приводит к истощению факторов антиэндотоксинового иммунитета. При этом резко снижаются титры антител к ЛПС,

содержание ПЯЛ, связывающих эндотоксин in vivo, в кровотоке. Также практически исчезают ПЯЛ, способные связывать эндотоксин in vitro. Резко снижаются резервы связывания эндотоксин антителами и гранулоцитами, и организм становится почти полностью беззащитным к повторным атакам вновь поступающего в кровь эндотоксина, и реализуются его патофизиологические эффекты .

Так, Дж. Меакинс и Дж. Маршалл еще в 1986 году впервые выдвинули гипотезу развития SIRS и ПОН в результате изменения проницаемости слизистой кишечника, что приводило к транслокации бактерий и токсинов в систему циркуляции .

Очевидно, в основе патогенеза атеросклероза лежат реакции, запускаемые вследствие взаимодействия То11-подобных рецепторов с экзогенными и эндогенными лигандами. После стимуляции лигандами То11-подобных рецепторов осуществляется передача сигнала к ядру клетки и активация транскрипционного фактора ОТ-кВ, что ведет к экспрессии целого ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, протективных факторов и других биоактивных молекул, в том числе факторов адгезии. Активация и альтерация клеток эндотелия и гладких мышц, активация макрофагов интимы артерий и их превращение в

ЭНДОТОКСИНОВАЯ АГРЕССИЯ (ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭНДОТОКСИНА)

Мишень для эндотоксина Высвобождаемые вещества Патофизиологическое действие Клинические проявления

Макрофаги 1Ь-1; ТОТ-а; 1Р^у; П-6 Активация фагоцитов; высвобождение простагландинов в гипоталамусе; разрегуляция всех воспалительных реакций; N0-индуцированная вазоди-латация Лихорадка; головокружение; повышение проницаемости капилляров, особенно в легких

Индуцибельное высвобождение N0

Комплемент С3а Вазодилатация повышенная проницаемость капилляров; активация фагоцитов Гипотензия; геморрагический синдром

Тромбоциты Тромбоцит-активирующий фактор Разрегулировка воспалительного процесса; агрегация тромбоцитов; прокоагулянт-ный эффект Вазодилатация, вызывающая гипотензию Внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром)

Тромбоксан А2

Тромбоцитарный фактор 3

Нейтрофи-лы Катионовые протеины Дегрануляция тучных клеток; синтез кинина; активация комплемента Артериальная гипотензия; повышенная проницаемость капилляров

Калликреин

Лизосомальные энзимы

Фактор Хагемана Активация кининовой системы; активация тромбооб-разующих и фибринолитиче-ских механизмов Высвобождение калликреина и кининов; усиленное потребление фибриногена Внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром); геморрагии как результат повышенного потребления фибриногена; артериальная гипотензия

пенистые клетки, насыщенные эфирами холестерина, ведут к формированию атеросклеротических бляшек, а повторяющееся поступление в кровоток экзогенных лигандов БоИ-рецепторов и активный выброс в кровоток при стрессовых состояниях их эндогенных лигандов способствуют прогресссиро-ванию атеросклероза. Эта точка зрения позволяет объединить различные представления о механизмах атерогенеза и роли так называемых факторов риска. Несмотря на интенсивное изучение функций образраспознающих рецепторов и Toll-подобных рецепторов, в частности, механизмы регуляции процессов, запускаемых взаимодействием рецепторов с их лигандами, практически не известны. Естественно, это затрудняет разработку мер предупреждения негативных последствий функционирования этих рецепторов. Имеющиеся у нас данные говорят о том, что пре- и пробиотические препараты могут подавлять индуцирующее действие ЛПС. Считается признанным, что повышение содержания холестерина в сыворотке является фактором риска, ассоциируемым с развитием атеросклероза и поражением коронарных сосудов, являющихся основной причиной смертности в западных странах. Для лечения таких больных используют многочисленные лекарственные препараты, снижающие содержание холестерина. Однако точки воздействия этих соединений, к примеру статинов, перекрещиваются с эндотоксинами, воздействуя диаметрально противоположно, что вызывает озабоченность относительно возможности их терапевтического применения в определенных клинических ситуациях. Прием пре- и пробиотиков является более естественным методом снижения холестерина в сыворотке людей. Так, прием этих препаратов оказывает довольно значительное профилактическое гипохолестеринемическое действие.

Обобщая известные на сегодня данные, касающиеся патогенеза атеросклероза, становится очевидным, что наука накопила огромное количество фактов о влиянии различных агентов на возникновение и течение атеросклероза. Под широким понятием «атеросклероз» скрываются патологические процессы с различными механизмами. Их объединяет лишь конечный морфологический субстрат в виде повреждения сосудистой стенки, заканчивающегося развитием атеросклеротической бляшки или специфического сужения сосуда.

Понятие «атеросклероз» некоторые авторы разделяют с понятием «артериосклероз», под которым они понимают уплотнение стенки артерий вследствие интрамурального фиброза и кальцификации последней, связанной с физиологическим старением или влиянием болезнетворных агентов (например, сифилитический артериолосклероз). Так как артериолосклероз может развиваться на фоне протекающего артериосклероза и последний, естественно, будет отягощать его развитие, то некоторые авторы предлагают для таких случаев ввести термин «артерио-атеросклероз» означающий ассоциацию этих поражений и вовлечение в процесс сосудистой стенки. Другие авторы, впадая в крайность иного рода, рекомендуют рассматривать атеросклероз как частный случай артериосклероза. Наконец, в зарубежной литературе иногда встречается отождествление понятий «атеросклероз» и «артериосклероз».

Очевидно, что атеросклероз представляющий собой самостоятельное заболевание, протекающее во внутренней оболочке артерий вследствие проникновения и накопления в ней липидов и связанных с этим последующим образованием фиброзных бляшек. Нет никаких оснований (патогенетических, морфологических и биохимических) путать и отождествлять атеросклероз с артериосклерозом

Определенная автономность механизмов доказывается тем, что не всегда возникновение ги-перлипидемии сразу ведет к развитию атероскле-ротических изменений в сосудах. И в то же время развитие атеросклероза в определенных условиях возможно и без предшествующей гиперлипидемии. Правда, наиболее часто встречающимся фактом является все же закономерная причинно-следственная связь между гиперлипидемией и атеросклеро-тическим повреждением сосудистой стенки, хотя для возникновения и реализации ее требуются определенные дополнительные факторы, одним из которых является эндотоксин грамотрицательных бактерий - один из наиболее активных и постоянно действующих факторов, способствующих атерогенезу. Поэтому необходимы проведение мониторинга за содержанием эндотоксина в кровотоке и разработка методов профилактики и терапии гиперэндотоксинемий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s // Nature. - 1993. - Vol. 362. - P. 801-809.

2. Климов А.Н., Нагорнев В.А. Взгляд на решение проблемы атеросклероза // Вестн. РАМН. - 1999. - № 9. - С. 33-37.

3. Конев Ю.В., ЛазебникЛ.Б. Метаболизм эндотоксина в организме и его роль в процессах инволюции // Клин. геронтол. - 2009. - Т. 15, № 1. - С. 39-46.

4. Конев Ю.В., Каган Л.Г., Трубникова И.А. Дисбиотические процессы в кишечнике у лиц старших возрастных групп // Справочник поликлинического врача. - 2009. - № 3. - С. 44-48.

5. Яковлев М.Ю. Элементы эндотоксиновой теории физиологии и патологии человека // Физиология человека. - 2003. - Т. 29, № 4. - С. 98-109.

6. Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М. Роль кишечной бактериальной аутофлоры и ее эндотоксина в патологии человека // Журн. микро-биол. - 2007. - № 3. - С. 103-111.

7. Cook D.N., Pisetsky D.S., Schwartz D.A. Toll-like receptors in the pathogenesis of human disease // Nature Immunol. - 2004. - Vol. 5,

№ 10. - P. 975-979.

8. Akira S, Sato S. Toll-like receptors and their signaling mechanisms // Scand. J. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 35, № 9. - P. 555-562. Review.

9. ЛыковаЕ.А., Бондаренко В.М., Воробьев А.А. и др. Бактериальная эндотоксинемия у детей кишечными дисбактериозами // Журн. микробиол. - 1999. - № 3. - С. 67-70.

10. ZhangH.Y., Han de W., Su A.R. et al. Intestinal endotoxemia plays a central role in development of hepatopulmonary syndrome in a cirrhotic rat model induced by multiple pathogenic factors // World J. Gastroenterol. - 2007. - Vol. 13, 47. - P. 6385-6395.

11. Yokude M, Kita T. The macrophage and its role in atherogenesis // Intern. Med. - 1995. - Vol. 34. - P. 281-283.

12. Erridge C., Stewart J., Poxton I.R. Monocytes heterozygous for the Asp299Gly and Thr399Ile mutations in the Toll-like receptor 4 gene show no deficit lipopolysaccharides signaling // J. Exp. Med. - 2003. - Vol. 197. - P. 1787-1791.

13. Majdalawieh A., Ro H.S. LPS-induced suppression of macrophage cholesterol efflux is mediated by adipocyte enhancer-binding protein 1 // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 2009. - Vol. 41, № 7. - P. 1518-1525. Epub 2009 Jan 8.

14. Taranto M.P., Perdigon G., MediciM. et al. Animal model for in vivo evaluation of cholesterol reduction by lactic acid bacteria // Methods Mol. Biol. - 2004. - Vol. 268. - P. 417-422.

15. Яковлев М.Ю., Лиходед В.Г., Пермяков Н.К., Конев Ю.В. Эндо-токсининдуцированные повреждения эндотелия // Арх. патол. - 1996. - Т. 58, № 2. - С. 41-46.

16. Ковальчук Л.В. Учение о воспалении в свете новых данных: развитие идей И.И. Мечникова // Журн. микробиол. - 2008. - № 5. - С. 10-15.

17. Liao W. Endotoxin: possible roles in initiation and development of

аtherosclerosis // J. Lab. Clin. Med. - 1996. - Vol. 128, № 5. - P. 452-460.

18. Ieven M.M., Hoymans V.Y. Involvement of Chlamydia pneumoniae in atherosclerosis: more evidence for lack of evidence // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, № 1. - P. 19-24.

19. Rakoff-Wahoum S., Paglino J., Eslami-VarzanehF. et al. Recognition of commensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis // Cell. - 2004. - Vol. 118, № 2. - P. 229-241.

20. БондаренкоВ.М., ГинцбургА.Л., ЛиходедВ.Г. Роль инфекционного фактора в патогенезе атеросклероза // Эпидемиол. и инфекционные болезни. - 2011. - № 1. - С. 7-12.

21. ЛиходедВ.Г., БондаренкоВ.М. Микробный фактор и toll-подобные рецепторы в патогенезе атеросклероза // Журн. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол. - 2009. - № 6. - С. 107-112.

22. Satoh M., Shimoda Y., Akatsu T. et al. Elevated rirculating levels of heat shock protein 70 are related to systemic inflammation reaction through monocyte Toll signal in patients with heart failure after acute myocardial infarction // Eur. Soc. Cardiol. - 2006. - Vol. 8. - P. 810-815.

23. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю. Определение эндотоксина грамотрицательных бактерий в крови человека // Журн. микробиол. - 2002. - № 2. - С. 83-89.

24. Лиходед В.Г., Конев Ю.В., Трубникова И.А. и др. Детекция эндотоксинов грамотрицательных бактерий по спектру частот электромагнитных излучений // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. - 2007. - № 3. - С. 3-6.

25. Fraunberger P., Grone E., Grone H.J, Walli A.K. Simvastatin reduces endotoxin-induced nuclear factor kappaB activation and mortality in guinea pigs despite lowering circulating low-density lipoprotein cholesterol // Shock. - 2009. - Vol. 32, № 2. - P. 159-163.

26. Bone R.C. Toward an epidemiology and natural history of SIRS (systemic inflammatory response syndrome) // JAMA. - 1992. - Vol.

268, № 24. - P. 3452-3455.

27. Meakins J.L., Marshall J.C., Carrico Memon R.F. et al. Multiple-organ-failure syndrome // Arch Surg. - 1986. - Vol. 121, № 2. - P. 196-208.

28. Чижиков Н.А., Лиходед В.Г., Светухин Ф.Б., Яковлев М.Ю. Эндотоксин кишечной микрофлоры в клинике и патогенезе хронической ишемии нижних конечностей. - Пенза, 2002. - 169 c.

29. Wiederman C.J., Kiechl S., Dunzendorfer S. et al. Endotoxemia and atherosclerosis // J. Endotox. Res. - 2000. - Vol. 6, № 2. - P. 86-88.

30. Яковлев М.Ю., Аниховская И.А., Мешков М.В., Яковлева М.М. Кишечный эндотоксин в регуляции активности системы гемостаза и патогенезе ДВС-синдрома // Физиология человека. - 2005. - № 6. - С. 91-96.

31. Stewart G.J., Anderson M.J. An ultrastructural study of endotoxin induced damage in rabbit mesenteric arteries // Brit. J. Exp. Pathol. - 1971. - Vol. 52. - P. 75-80.

32. Memon R.F. et al. Endotoxin, tumor necrosis factor? And interleikin-1 decrease hepatic squalene synthase activity, protein, and mRNA levels in Syrian hamsters // J. Lipid Res. -1997. - Vol. 38. - P. 1620-1629.

33. Ulevitch R.J. Therapeutics targeting and innate immune system // Nature Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 4. - P. 512-520.

Токсические вещества, синтезируемые бактериями, по химической природе относятся к белкам (экзотоксины) и ЛПС (эндотоксины) – локализуются в стенке Б!! и освобождаются только после их разрушения.

Эндотоксины. К ним относятся липополисахариды (ЛПС), которые содержатся в клеточной стенке грамотрицательных бак­терий. Токсические свойства определяются всей молекулой ЛПС , а не отдельными ее частями: ПС или липидом А. Хорошо изучены эндотоксины энтеробактерий (эшерихии, шигеллы и сальмонеллы, бруцеллы, туляремийные бактерии).

ЛПС (эндотоксины) в отличие от экзотоксинов более устойчивы к повышенной t°С, менее ядовиты и малоспецифичны. При введении в  подопытных Ж!! вызывают примерно одинаковую реакцию, независимую от того, из каких гр– Б!! они выделены. При ВВЕДЕНИИ БОЛЬШИХ ДОЗ наблюдается угнетение фагоцитоза, явления токсикоза, слабость, одышка, расстройством кишечника (диарея), падением деятель­ности и ↓ t°С тела. При введении НЕБОЛЬШИХ ДОЗ – обратный эффект: стимуляция фагоцитоза, t°С тела.

У ЛЮДЕЙ поступление эндотоксинов в кровяное русло приво­дит к лихорадке в результате их действия на клетки крови (гранулоциты, моноциты), из которых выделяются эндогенные пирогены. Возникает ранняя лейкопения , которая сменяется вторичным лейкоцитозом . Усиливается гликолиз  может возникнуть гипо­гликемия. Также развивается гипотония (по­ступление в кровь количества серотонина и кининов), нарушается кровоснабжение органов и ацидоз.

ЛПС активирует фракцию С3 комплемента по АЛЬТЕРНАТИВНОМУ ПУТИ  ↓ его содержания в сыворотке и накопление биологически активных фракций (С3а, С3b, С5а и др.). Большие количества поступившего в кровь эндоток­сина приводят к ТОКСИКО-СЕПТИЧЕСКОМУ ШОКУ.

ЛПС – сравнительно слабый иммуноген. Сыворотка крови животных, иммунизированных чистым эндотоксином, не облада­ет высокой антитоксической активностью  не способна полно­стью нейтрализовать его ядовитые свойства.

Некоторые бактерии одновременно образуют как белковые токсины, так и эндотоксины, например кишечная палочка и др.

ферменты и антигены патогенности

Ферменты патогенности - это факторы агрессии и защиты микроорганизмов. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- возможность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие барьеры. К ним относятся различные литические ферменты- гиалуронидаза, коллагеназа, лецитиназа, нейраминидаза, коагулаза, протеазы. Более подробно их характеристика дана в лекции по физиологии микроорганизмов.

Важнейшими факторами патогенности считают токсины , которые можно разделить на две большие группы- экзотоксины и эндотоксины .

Экзотоксины продуцируются во внешнюю среду (организм хозяина), обычно белковой природы, могут проявлять ферментативную активность, могут секретировать как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями. Они обладают очень высокой токсичностью, термически нестойки, часто проявляют антиметаболитные свойства. Экзотоксины проявляют высокую иммуногенность и вызывают образование специфических нейтрализующих антител- антитоксинов. По механизму действия и точке приложения экзотоксины отличаются- цитотоксины (энтеротоксины и дерматонекротоксины), мембранотоксины (гемолизины, лейкоцидины), функциональные блокаторы (холероген), эксфолианты и эритрогенины. Микробы, способные продуцировать экзотоксины, называют токсигенными.

Эндотоксины высвобождаются только при гибели бактерий, характерны для грамотрицательных бактерий, представляют собой сложные химические соединения клеточной стенки (ЛПС)- подробнее смотри лекцию по химическому составу бактерий. Токсичность определяется липидом А, токсин относительно термостоек; иммуногенные и токсические свойства выражены более слабо, чем у экзотоксинов.

Наличие капсул у бактерий затрудняет начальные этапы защитных реакций- распознавание и поглощение (фагоцитоз). Существенным фактором инвазивности является подвижность бактерий, обусловливающая проникновение микробов в клетки и в межклеточные пространства.

Факторы патогенности контролируются:

- генами хромосомы;

- генами плазмид;

- генами, привнесенными умеренными фагами.

Биологический микроскоп.

Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20–30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы.

В микробиологических исследованиях применяют световые и элек­тронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.

Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микро­скопа являются объективы, которые делятся на сухие и иммерсионные.

Сухие объективы с относительно большим фокусным расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, име­ющих крупные размеры (более 10–20 мкм), иммерсионные (лат. immersio – погружение) с фокусным расстоянием – при иссле­довании более мелких микробов.

При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным ус­ловием является его погружение в кедровое, персиковое или в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты. В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разре­шающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигает 1350.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив малого увеличения и при помощи плоского зеркала освеща­ют поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят кап­лю масла, в которую под контролем гла­за осторожно погружают объектив, за­тем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро–, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объ­екта. По окончании работы удаляют салфеткой масло с фронтальной линзы объектива.

Микроскопия в темном поле зрения проводится при боковом освещении и обычно применяется при изучении подвижности бактерий или обнаружении патогенных спирохет, поперечник которых может быть меньше 0,2 мкм. Чтобы по­лучить яркое боковое освещение, обыч­ный конденсор заменяют специальным параболоидом–конденсором, в ко­тором центральная часть нижней линзы затемнена, а боковая поверхность зеркальная. Этот конденсор задерживает центральную часть параллель­ного пучка лучей, образуя темное поле зрения. Краевые лучи проходят через кольцевую щель, попадают на боковую зеркальную поверхность конденсора, отражаются от нее и концентрируются в его фокусе. Если на пути луча нет каких–либо частиц, он преломляется, падая на боковую зеркальную поверхность, отражается от нее и выходит из конденсора. Когда луч встречает на своем пути микробы, свет отражается от них и попадает в объектив – клетки ярко светятся. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зер­кало микроскопа. Обычно исследование в темном поле зрения проводится под сухой системой. При этом небольшую каплю материала поме­щают на предметное стекло и накрывают покровным, не допуская обра­зования пузырьков воздуха.

Фазово–контрастная и аноптральная микроскопия основаны на том, что оптическая длина пути света в любом веществе зависит от показателя преломления. Это свойство используют с целью увеличить контрастность изображения прозрачных объектов, какими являются микробы, т. е. для изучения деталей их внутреннего строения. Световые волны, проходя через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе от световых волн, не проходящих через них. При этом интенсивность света не меняется, а только изменяется фаза колебания, не улавливаемая глазом и фотопластинкой. Для повышения контрастности изображения фазовые колебания при помощи специальной оптической системы превращаются в амплитудные, хорошо улавливаемые глазом. Препараты в световом поле зрения становятся более контрастными – положительный контраст; при отрицательном фазовом контрасте на темном фоне виден светлый объект. Вокруг изображений нередко возникает ореол.

Большей четкости изображения малоконтрастных живых микробов (даже некоторых вирусов) достигают в аноптральном микроскопе. Одной из важнейших его деталей является линза объектива, расположенная вблизи «выходного» зрачка, на которую нанесен слой копоти или меди, поглощающий не менее 10 % света. Благодаря этому фон поля зрения приобретает коричневый цвет, микроскопируемые объекты имеют раз­личные оттенки – от белого до золотисто–коричневого.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Бактериальные ОФС.1.2.4.0006.15
эндотоксины Взамен ГФ XII, ч.1 ОФС 42-0062-07

Настоящая статья описывает методы определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения и фармацевтических субстанциях, используемых для их изготовления.

Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив) . ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами. В результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина.

Существуют три основных методологических подхода для проведения данного испытания: гель-тромб метод, основанный на образовании геля; турбидиметрический метод, основанный на помутнении реакционной смеси после расщепления субстрата, содержащегося в ЛАЛ-реактиве; и хромогенный метод, основанный на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид-хромогенного комплекса.

В данной статье описаны следующие шесть тестов, основанных на описанных выше принципах:

• – Качественный гель-тромб тест (Метод А);
• – Количественный гель-тромб тест (Метод В);
• – Турбидиметрический кинетический тест (Метод С);
• – Хромогенный кинетический тест (Метод D);
• – Хромогенный тест по конечной точке (Метод Е);
• – Турбидиметрический тест по конечной точке (Метод F).

Испытание проводят любым из шести приведенных методов. В случае сомнений или разногласий окончательное заключение принимают на основании результатов, полученных при проведении испытания методом А.

Посуда и ее подготовка

Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должна оказывать влияния на ход реакции.

Стандарты эндотоксина

При проведении анализа может использоваться Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ), активность которого установлена по Международному стандарту эндотоксина. КСЭ должен быть предназначен для проведения анализа с данной партией ЛАЛ-реактива (или ТАЛ-реактива) . Растворение и хранение КСЭ осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

ЛАЛ-реактив

Необходимо использовать ЛАЛ-реактив, предназначенный для выбранного метода определения бактериальных эндотоксинов.

Чувствительность реактива (l) выражена в единицах эндотоксина [ЕЭ/мл] и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом (Методы А и В), или соответствует точке с минимальным значением на стандартной кривой (Методы С, D, E и F).

Разведение лиофилизированного ЛАЛ-реактива и его хранение осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

Примечание: ЛАЛ-реактив, кроме эндотоксинов, может реагировать и с некоторыми β-гликанами, поэтому возможно использование специфического ЛАЛ-реактива, у которого удален фактор G, реагирующий с гликанами. Также разрешается применение вспомогательных растворов, которые блокируют реакционную систему фактора G. Такие реактивы могут применяться для определения эндотоксинов в присутствии гликанов.

Вода для ЛАЛ-теста

Для приготовления растворов реактивов и разведений испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте.

Подготовка испытуемого образца

Каждый отобранный образец испытывается индивидуально.

Для растворения и/или разведения испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста, если в фармакопейной статье не указан иной растворитель. Испытуемый раствор должен иметь рН в пределах, указанных производителем ЛАЛ-реактива, обычно 6,0 – 8,0. В случае необходимости рН доводят до нужного значения растворами кислоты, основания или с помощью буферного раствора. Используемые растворы не должны содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должны оказывать влияния на ход реакции.

Максимально допустимое разведение испытуемого лекарственного средства

Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства.

Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле:

«предельное содержание бактериальных эндотоксинов» — допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в фармакопейной статье;

«концентрация испытуемого раствора» — концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов

— чувствительность ЛАЛ-реактива, в ЕЭ/мл.

Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу:

К — пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 час для испытуемого лекарственного препарата (если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального). При интратекальном пути введения лекарственного препарата К составляет 0,2 ЕЭ/кг;

М — максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного часа (выражается в мг, мл или ЕД на 1 кг массы тела).

Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых внутривенно, предельное содержание бактериальных эндотоксинов рассчитывают как 175/V, где V – максимальная рекомендованная доза в мл. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых интратекально, предельное содержание бактериальных эндотоксинов равняется 14/V.

Для лекарственных препаратов, доза которых рассчитывается на м 2 поверхности тела (например, противоопухолевые препараты), пороговая пирогенная доза (К) составляет 100 ЕЭ/м 2 .

Гель-тромб тест (Методы А и В)

Гель-тромб метод позволяет установить наличие или измерить количественно концентрацию эндотоксинов в пробе. В результате реакции ЛАЛ-реактива с эндотоксином увеличивается вязкость реакционной смеси вплоть до формирования плотного геля.

Для обеспечения точности и достоверности испытаний заявленную чувствительность ЛАЛ-реактива следует подтвердить, а также провести испытание на наличие мешающих факторов, как описано в разделе «Предварительные анализы».

Процедура испытания

В круглодонные пробирки диаметром 10 мм вносят равные объемы испытуемого раствора и ЛАЛ-реактива (по 0,1 мл). Реакционные смеси аккуратно перемешивают и инкубируют при температуре 37 ± 1 °С в течение 60 ± 2 минут. Во время инкубирования следует избегать вибрации и ударов. По истечении указанного срока визуально регистрируют результаты как положительные или отрицательные. Положительная реакция (+) характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки на 180°. Отрицательная реакция (–) характеризуется отсутствием такого геля.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива

Анализ проводят для каждой новой серии используемого ЛАЛ-реактива, а также при изменении условий эксперимента, используемых материалов и реактивов, способных повлиять на результаты теста.

Процедура испытания

Растворы C и D по схеме, приведенной в Таблице 1.

Таблица 1 — Схема эксперимента «

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (проверка чувствительности ЛАЛ-реактива);

Раствор D

Опыт проводят, как описано в разделе «Процедура анализа» .

Результаты и интерпретация

• — для раствора D (отрицательный контроль) во всех повторностях получены отрицательные результаты;
• — для раствора С с концентрацией 2l, получены положительные результаты;
• — для раствора С с концентрацией 0,25l, получены отрицательные результаты.

Конечной точкой реакции для каждой из повторностей раствора С является положительный результат, полученный для раствора с наименьшей концентрацией КСЭ. По этим результатам рассчитывается среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива по следующей формуле:

где:

– сумма логарифмов концентраций КСЭ в конечной точке реакции в каждой из повторностей;

f – число повторностей.

Заявленная чувствительность ЛАЛ-реактива считается подтвержденной и используется в дальнейших расчетах в том случае, если полученное в эксперименте значение чувствительности ЛАЛ-реактива, не менее 0,5 и не более 2.

Мешающие факторы

Испытуемое лекарственное средство может содержать мешающие факторы, усиливающие и/или ингибирующие реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами. Обнаружить эти явления можно, сравнив способность используемого ЛАЛ-реактива реагировать с раствором КСЭ в воде для ЛАЛ-теста и в растворе испытуемого лекарственного средства в стандартных условиях проведения эксперимента.

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР. Используемые в данном анализе пробы испытуемого лекарственного средства (или его разведения) не должны содержать бактериальных эндотоксинов в определяемых в тесте количествах.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят растворы А – D по схеме, приведенной в Таблице 2.

Раствор А – испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении (контроль отсутствия бактериальных эндотоксинов);

Растворы В – серия разведений КСЭ в растворе испытуемого лекарственного средства (выявление возможности ингибирования или усиления реакции);

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (положительный контроль);

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Таблица 2 — Схема эксперимента «Мешающие факторы»

Результаты и интерпретация

Результаты эксперимента считаются достоверными, если:Опыт проводят, как описано в разделе «Процедура анализа» .

– для растворов А и D получены отрицательные результаты во всех повторностях;

– для растворов С (положительный контроль) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 и не более 2.

По результатам, полученным для каждой из повторностей растворов В , рассчитывают среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива. Расчет проводят, как описано в разделе «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива» . Если полученное среднее значение оказалось не менее 0,5l и не более 2l, считают доказанным, что испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении не содержит мешающих факторов, способных ингибировать и/или усиливать реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами и оно может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если обнаружено присутствие мешающих факторов для испытуемого лекарственного средства, которое проверялось в разведении, меньшем МДР, анализ повторяют в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. В большинстве случаев дополнительное разведение испытуемого лекарственного средства способно устранить действие мешающих факторов. Использование ЛАЛ-реактива большей чувствительности позволяет увеличить степень разведения.

Действие мешающих факторов может быть преодолено соответствующей подготовкой образца, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурной обработкой. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен изменять концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому к раствору испытуемого лекарственного средства КСЭ известной концентрации добавляют перед проведением такой обработки, после чего проводят анализ «Мешающие факторы» . Если после обработки выбранным способом результаты анализа окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если испытуемое лекарственное средство нельзя освободить от мешающих факторов, оно не может быть исследовано на предмет содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод А)

Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят Растворы А – D по схеме, приведенной в Таблице 3.

Раствор А – испытуемое лекарственное средство в разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы, или в большем разведении, не превышающем МДР;

Раствор В – испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 (положительный контроль испытуемого образца).

Раствор С – раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с конечной концентрацией 2 (положительный контроль).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе «Процедура анализа».

Таблица 3 — Схема эксперимента «Качественный анализ»

Результаты и интерпретация

Анализ считают достоверным, если:

– для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях,

– для раствора С (положительный контроль) во всех повторностях получены положительные результаты,

– для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) в обеих повторностях получены положительные результаты.

Если для раствора А в двух повторностях получены отрицательные результаты, лекарственное средство считают выдержавшим испытания.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, меньшем МДР, в двух повторностях получены положительные результаты, анализ следует повторить в большем разведении или в разведении, равном МДР.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, равном МДР, в двух повторностях получены положительные результаты, то лекарственное средство не соответствует требованиям раздела «Бактериальные эндотоксины» фармакопейной статьи.

Если положительный результат получен в одной из повторностей для раствора А , то проводят повторный анализ. Лекарственное средство считается выдержавшим испытания, если в повторном анализе для двух повторностей получены отрицательные результаты.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод В)

Этим методом определяют содержание бактериальных эндотоксинов с помощью ряда последовательных разведений испытуемого лекарственного средства.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят Растворы A – D по схеме, приведенной в Таблице 4.

Растворы А – разведения испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР.

Раствор В – наименьшее разведение из серии разведений раствора А, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 (положительный контроль испытуемого образца).

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (положительный контроль).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе «Процедура анализа» .

Таблица 4 — Схема эксперимента «Количественный анализ»

Результаты и интерпретация

Анализ считают достоверным, если:

– для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в двух повторностях,

– для растворов С (положительный контроль) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5и не более 2.

– для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в двух повторностях,

Для растворов А конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства.

Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (l) равно концентрации эндотоксина в растворе А , полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива» .

Если во всех повторностях серии растворов А получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве меньше величины произведения чувствительности ЛАЛ-реактива и наименьшего фактора разведения. Если во всех повторностях серии растворов А получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве больше величины произведения чувствительности ЛАЛ-реактива и наибольшего фактора разведения.

Лекарственное средство считают выдержавшим испытание, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (Методы C , D , E и F ) ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (C и F )

Турбидиметрические методы относятся к фотометрическим методам, основанным на измерении степени мутности реакционной смеси. В зависимости от принципа, положенного в основу проведения испытания, указанный метод может быть проведен как турбидиметрический тест по конечной точке, либо как турбидиметрический кинетический анализ.

Турбидиметрический тест по конечной точке (Метод F) основан на измерении степени мутности реакционной смеси в конце инкубационного периода, которая зависит от концентрации эндотоксина.

Турбидиметрический кинетический тест (Метод С) основан на определении скорости развития мутности реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности.

ХРОМОГЕННЫЕ МЕТОДЫ (D и E)

Хромогенные методы используют для измерения количества хромофора, высвободившегося из хромогенного субстрата в результате реакции эндотоксинов с ЛАЛ-реактивом. В зависимости от принципа, положенного в основу испытания, этот метод может быть проведен как хромогенный тест по конечной точке или как хромогенный кинетический анализ.

Хромогенный тест по конечной точке (Метод Е) основан на измерении интенсивности окраски реакционной смеси, зависящей от количества хромофора, высвободившегося в конце инкубационного периода. Количество, выделившегося хромофора, зависит от концентрации эндотоксина.

В процессе испытания хромогенным кинетическим методом (метод D) определяют скорость развития окраски реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности реакционной смеси.

Испытание проводят при температуре инкубирования, рекомендованной производителем ЛАЛ-реактива (обычно 37 ± 1°С).

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Для подтверждения достоверности и точности испытания турбидиметрическим или хромогенным методом проводят предварительные анализы, позволяющие убедиться в достоверности критериев для стандартной кривой и в том, что испытуемый раствор не содержит факторов, мешающих проведению реакции.

При внесении любых изменений, способных повлиять на результаты эксперимента, требуется дополнительное подтверждение достоверности и точности испытания.

Проверка достоверности критериев стандартной кривой

Анализ проводят для каждой новой серии ЛАЛ-реактива.

Для построения стандартной кривой из исходного раствора КСЭ готовят не менее трех различных концентраций эндотоксина в соответствии с рекомендациями производителя ЛАЛ-реактива. Анализ проводят, как минимум, в трех повторностях в условиях, предусмотренных производителем ЛАЛ-реактива (объемные соотношения, время инкубирования, температура, рН и т.д.).

Если в кинетических методах необходимо построить стандартную кривую с диапазоном КСЭ, превышающим 2 lg величины концентрации эндотоксина для каждого изменения диапазона измерения на lg величины концентраций эндотоксина, в схему опыта необходимо включить раствор КСЭ соответствующей концентрации.

Для проверяемого диапазона концентраций эндотоксина абсолютное значение коэффициента корреляции |r| должно быть равно или более 0,980.

Мешающие факторы

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР.

Процедура испытания

Готовят растворы A – D, как указано в Таблице 5. Испытание растворов A, B, C и D проводят по меньшей мере в двух повторностях, в соответствии с рекомендациями производителя ЛАЛ-реактива (объемы и объемные соотношения испытуемого препарата и ЛАЛ-реактива, время инкубирования, температура, рН и т.д.).

Таблица 5 — Схема эксперимента «Мешающие факторы»

Раствор А - раствор испытуемого лекарственного средства в разведении, не превышающем значение МДР;

Раствор В - испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна соответствовать или быть близкой среднему значению концентраций КСЭ, использованных для построения стандартной кривой (положительный контроль испытуемого образца);

Растворы С - растворы КСЭ, используемые для построения стандартной кривой в тех же концентрациях, которые использовались при проведении анализа «Проверка достоверности критериев стандартной кривой» (положительный контроль);

Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

– результаты, полученные для стандартной кривой (Раствор С) соответствуют требованиям достоверности, установленным в разделе «Проверка достоверности критериев для стандартной кривой»;

– результат, полученный для раствора D (отрицательный контроль) не превышает значения величины, указанной в инструкции к используемому ЛАЛ-реактиву или менее концентрации эндотоксина, определяемой используемым методом.

Полученное в опыте среднее значение концентрации добавленного эндотоксина рассчитывают, вычитая из среднего значения концентрации эндотоксина в растворе В (содержащего добавленный эндотоксин) среднее значение концентрации эндотоксина в растворе А (при его наличии).

Считают доказанным, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если в условиях испытания измеренная концентрация эндотоксина, добавленного в испытуемый раствор, составляет 50-200% от известной концентрации добавленного эндотоксина.

Если определенная в опыте концентрация эндотоксина не укладывается в заданные рамки, делают заключение, что испытуемый препарат содержит факторы, мешающие реакции. В этом случае опыт может быть повторен в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. Помимо большего разведения испытуемого препарата, влияние мешающих факторов может быть преодолено соответствующей обработкой, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурным воздействием. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен приводить к уменьшению концентрации бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому перед проведением такой обработки к испытуемому раствору следует сначала добавить раствор КСЭ известной концентрации, после чего повторить анализ «Мешающие факторы». Если после обработки выбранным способом результаты анализа окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Проведение испытания

Процедура испытания

Испытание проводят в соответствии с методикой, приведенной в разделе «Мешающие факторы».

Результаты

Для раствора А в каждой повторности определяют концентрацию эндотоксинов, используя стандартную кривую, полученную на основании серий разведений КСЭ (Раствор С ).

Испытание считают достоверным, если соблюдены следующие условия:

1. результаты, полученные для стандартной кривой (Растворы С ), соответствуют требованиям достоверности, установленным в разделе «Проверка достоверности критериев для стандартной кривой »;
2. определенная в опыте концентрация эндотоксина, добавленного к раствору B после вычитания значения концентрации эндотоксина, определённого в растворе А , находится в пределах от 50 до 200% от известной величины;
3. результат, полученный для раствора D (отрицательный контроль), не превышает значения величины, указанной в инструкции к используемому ЛАЛ-реактиву или менее концентрации эндотоксина, определяемой используемым методом.

Интерпретация результатов

Лекарственное средство считают выдержавшим испытание, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов в повторностях раствора А (с учетом разведения и концентрации испытуемого лекарственного средства) менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

Примечание: Контрольный стандарт эндотоксина и ЛАЛ-реактив или ТАЛ-реактив должны быть зарегистрированы в МЗ РФ.

GPM.1.2.4.0006.15 Bacterial endotoxins

Ministry of Health of the Russian Federation

General Pharmacopoeia Monograph

Bacterial endotoxins GPM .1.2.4.0006.15
Replaces the State Pharmacopoeia of the Russian Federation XII, Part 1 Monograph, GPM 42-0062-07

The present General Pharmacopoeia Monograph describes the methods used to detect bacterial endotoxins in medicinal products designed for parenteral administration and drug substances used to manufacture such products.

The bacterial endotoxins assay is carried out using a reagent, which presents a lysate of blood cells (amoebocytes) from horseshoe crab: Limulus polyphemus (LAL-reagent) or Tachypleus tridentatus (TAL-reagent ). LAL reagents interact specifically with bacterial endotoxins. As a result of an enzymatic reaction, the reactant mixture undergoes a change proportionate to the concentration of the endotoxin.

There are three major methodological approaches to performing this test: the gel clot assay based on gel formation; the turbidimetric principle in which the reactant mixture becomes turbid after degradation of the substrate contained in the LAL reagent; and the chromogenic principle based on the colour induced by degradation of a synthetic peptide – chromogenic complex.

The present Pharmacopoeia Monograph describes the following six tests based on the aforementioned principles:

– Qualitative gel clot assay (Method А);

– Quantitative gel clot assay (Method В);

– Turbidimetric kinetic test (Method С);

– Chromogenic kinetic test (Method D);

– Chromogenic endpoint assay (Method Е);

– Turbidimetric endpoint assay (Method F).

The test may be performed using any of the six aforementioned methods. In case of any doubts or discrepancies, the final conclusion should be made on the basis of results obtained using Method A.

Laboratory utensils and their preparation

Glass and plastic laboratory ware used in the LAL-test should not contain bacterial endotoxins in quantities detected in this test, and should not affect the course of the reaction.

The recommended depyrogenation regimen is heating at temperature 250 °C over at least 30 minutes in accordance with the validated procedure.

Endotoxin standards

Content of bacterial endotoxins is expressed in Endotoxin Units (EU) of the International Endotoxin Standard. One endotoxin International Unit (IU) corresponds to one EU.

Analysis may also be based on the Endotoxin Reference Standard (ERS); its activity is established according to the International Standard for endotoxins. An Endotoxin Reference Standard should be designed for testing a particular LAL-reagent (TAL-reagent) lot . Dissolution and storage of the ERS are carried out according to the manufacturer’s Instructions for Use.

LAL reagent

The LAL-reagent designed for the selected bacterial endotoxins testing method should be used.

LAL-reagent sensitivity (λ) is expressed in endotoxin units , and corresponds to the minimum International Endotoxin Standard concentration that promotes the formation of a dense gel when reacting with the particular LAL-reagent (Methods А and В) or corresponds to the minimum value point on the standard curve (Methods С, D, E, and F).

Dissolution of the lyophilized LAL-reagent and its storage are carried out in accordance with the manufacturer’s Instructions for Use.

Note: Apart from endotoxins, a LAL reagent may also react with some β -glycans, and therefore a specific LAL reagent deprived of the G-factor, which reacts with glycans, may be employed. Use of accessorial solutions that block the G factor reacting system is allowed as well. These reagents may be used for the determination of endotoxins in the presence of glycans.

Water for LAL testing

Water for LAL-testing is used for preparation of all reagents and dilutions of the tested medicinal product. Water for LAL-testing should comply with the requirements established for Water for Injections, and it should not contain bacterial endotoxins in quantities detectable by the test.

Preparation of the tested sample

Every selected sample should be tested individually.

Water for LAL-testing is used to dissolve and / or dilute the tested medicinal product, unless otherwise specified in the Pharmacopoeia Monograph. The tested solution should have its pH value within the range specified by the manufacturer of the LAL-reagent, most commonly 6.0 – 8.0. When necessary, the pH value of the tested solution is adjusted using acidic or basic solutions, or a buffer solution. The employed solutions should not contain bacterial endotoxins in quantities detectable by the test, and should not affect the course of the reaction.

Maximum acceptable dilution of the tested medicinal product

The maximum acceptable dilution (MAD) is the highest dilution of the tested medicinal product in which the endotoxin concentration corresponding to the maximum content of bacterial endotoxins approved for the particular medicinal product can be detected.

The tested medicinal product can be tested either in one dilution or in a series of dilutions, provided that the final dilution does not exceed the MAD value, which is calculated according to the following equation:

where: “maximum content of bacterial endotoxins ” is the admissible content of bacterial endotoxins in the tested medicinal product, as specified in the Pharmacopoeia Monograph;

“concentration of the tested solution ” is the concentration of the medicinal product or active ingredient for which the maximum content of bacterial endotoxins is established;

λ is the sensitivity of the LAL reagent (EU/mL).

The following equation is used to calculate the maximum content of bacterial endotoxins:

where: K — is the threshold pyrogenic dose equal to 5 EU/kg per hour for the tested medicinal product (if the latter is administered to patients through any parenteral route, except for the intrathecal route). If the drug is administered through the intrathecal route, the K value is 0.2 EU/kg;

М — maximum therapeutic dose of the tested medicinal product administered over a period of one hour (expressed in mg, mL, or units per kg of body weight).

For radiopharmaceutical medicinal products administered intravenously, the maximum content of bacterial endotoxins is calculated as 175 / V, where V is the maximum recommended dose (mL). For radiopharmaceutical medicinal products administered intrathecally, the maximum content of bacterial endotoxins is calculated as 14 / V.

If doses of the medicinal product are expressed per square metre of body surface area (such as antineoplastic drugs), the threshold pyrogenic dose (K) is set at 100 EU/m 2 .

Gel clot assay (Methods А and В )

The gel clot method permits detection or quantification of endotoxins in a sample. The reaction between the LAL reagent and the endotoxin results in an increase in the viscidity of the reaction mixture until a dense gel is formed.

To ensure accuracy and reliability of test results, the claimed sensitivity of the LAL reagent should be verified, and a test for the presence of interfering factors should be performed as described in the “Preparatory testing ” section.

Procedure description. Transfer equal volumes of the tested solution and the LAL-reagent (0.1 mL of each) into round-bottomed test tubes with a diameter of 10 mm. Mix carefully the reaction mixtures, and incubate at temperature 37 ± 1 °C over 60 ± 2 minutes. During incubation, vibration and mechanical shocks should be avoided. After the specified period of time, results are assessed by visual examination as positive or negative. A positive reaction (+) is characterized by the formation of a dense gel, which is not destroyed by a single careful 180° turn of the test tube. A negative reaction (-) is characterized by the absence of such gel.

PREPARATORY TESTING

This analysis is carried out for each new batch of the used LAL-reagent, as well as upon any changes in the experimental conditions, used materials and reagents that could have an effect on test results.

Procedure description. For this test, solutions C and D are prepared in accordance with the requirements of Table 1.

Table 1 – Experiment design, “Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity”

The Solutions C series consists of ERS dilutions in Water for LAL-testing (LAL-reagent sensitivity verification);

Solution D

The test is carried out as described in the “Procedure description” section.

Results and interpretation An analysis is considered valid if the following conditions are fulfilled:

— for Solution D (negative control) — negative results are obtained in all test replicates;

— for Solution C with the 2λ concentration – positive results are obtained;

— for Solution C with the 0.25λ concentration – negative results are obtained.

The reaction end-point for each replicate of the Solutions C series is a positive result obtained for the solution with the lowest ERS concentration. These results are used to calculate the geometric mean value of LAL-reagent sensitivity; the calculation is performed according to the following equation:

Geometric mean of ERS concentrations at reaction end-point

=

antilog (),

where: e is the sum of logarithms of the ERS concentrations at reaction end-points in each of the replicates;

f is the number of replicates.

The claimed LAL-reagent sensitivity is considered validated and can be used in subsequent calculation, provided that the LAL-reagent sensitivity value obtained in the test is not below 0.5λ and does not exceed 2λ.

Interfering factors

The tested medicinal product may contain interfering factors intensifying and / or inhibiting the reaction of the LAL-reagent with the bacterial endotoxins. These events may be recognized through comparison of the ability of the used LAL-reagent to react with the ERS solution in Water for LAL-testing and in the solution of the tested medicinal product under the standard experimental conditions.

A medicinal product may be tested in any dilution not exceeding the MAD value. The samples of the tested medicinal product (or its dilution) used in this analysis should not contain bacterial endotoxins in quantities detectable by the test.

Procedure description . For this analysis, Solutions A – D are prepared according to the requirements included in Table 2.

Solution A – the tested medicinal product in the selected dilution (control for the absence of bacterial endotoxins).

Solutions B – the series of ERS dilutions in the solution of the tested medicinal product (test detecting the possibility of reaction inhibition or intensification).

Solutions C

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

Table 2 –

This test should be carried out as described in the “Procedure description ” section.

Results and interpretation. A test may be considered reliable if the following conditions are fulfilled:

• for Solutions A and D — negative results are obtained in all replicates;
• for Solutions C (positive control) – the geometric mean value of the bacterial endotoxins concentration should be not less than 0.5λ and not more than 2λ.

Results obtained in each replicate of the Solutions B series are employed to calculate the geometric mean value of LAL-reagent sensitivity. The calculation is carried out as described in the “Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity ” section. If the obtained mean sensitivity value is not less than 0.5λ and not more than 2λ, this means that the tested medicinal product in the particular dilution does not contain any interfering factors capable of inhibition and / or intensification of the reaction of the LAL-reagent with bacterial endotoxins, and it therefore may be analyzed for bacterial endotoxins content.

If a presence of interfering factors has been demonstrated for the tested medicinal product analyzed in a dilution lower than the MAD, the test should be repeated for a higher dilution, up to the dilution equal to the MAD. In most cases, additional dilution of the tested medicinal product is capable of eliminating the effects of interfering factors. The use of a LAL-reagent with a higher sensitivity will allow to increase the degree of dilution.

The effects of interfering factors can be overcome with appropriate sample preparation, such as filtration, neutralization, dialysis, or temperature processing. The method selected to remove interfering factors should not change the concentration of bacterial endotoxins in the tested medicinal product, and therefore the ERS with the known concentration is added to the solution of the tested medicinal product before such processing, while the Interfering Factors analysis is carried out afterwards. If the selected method of processing is associated with satisfactory results of the Interfering Factors test, the tested medicinal product may be analyzed for bacterial endotoxins content.

If the interfering factors cannot be removed from the tested medicinal product, the latter cannot be tested for bacterial endotoxins content using the LAL-test.

QUALITATIVE ANALYSIS (Method А)

The objective of this analysis is to demonstrate that the content of bacterial endotoxins in the tested medicinal product sample does not exceed the Maximum Content of Bacterial Endotoxins specified in the Pharmacopoeia Monograph.

Procedure description. For this analysis, Solutions A – D should be prepared according to the requirements presented in Table 3.

Solution A – the tested medicinal product in the dilution containing no interfering factors, or in a higher dilution, provided that it does not exceed the MAD value.

Solution B – the tested medicinal product in the selected dilution, with the Endotoxin Reference Standard added. The final endotoxin concentration in the analyzed solution should be 2λ (positive control of the tested medicinal product).

Solution C – the ERS solution in Water for LAL-testing with final concentration 2λ (positive control).

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

Table 3 — Experiment design, “Qualitative analysis”

Results and interpretation .

• for Solution D
• for Solution C (positive control) – positive results are obtained in all replicates;
• for Solution B (positive control of the tested sample) — positive results are obtained in both replicates.

If negative results are obtained for Solution A in both replicates, the medicinal product complies with the requirements of the test.

If a positive result is obtained for both replicates for the tested medicinal product’s dilution less than the MAD, the test should be repeated for a higher dilution or the dilution equal to the MAD.

If a positive result is obtained for both replicates for the tested medicinal product’s dilution equal to the MAD, such medicinal product does not comply with the requirements of the Bacterial Endotoxins Section of the Pharmacopoeia Monograph.

If a positive result is obtained for one of the replicates for Solution A , a repeat test should be carried out. If negative results are obtained for both replicates in the second test, such medicinal product has passed the test.

QUANTITATIVE ANALYSIS (Method В)

This method serves to determine the content of bacterial endotoxins using a series of successive dilutions of the tested medicinal product.

Procedure description. For this analysis, Solutions A – D should be prepared according to the requirements presented in Table 4.

Solutions A – the dilutions of the tested medicinal product, beginning from the dilution containing no interfering factors to the highest dilution not exceeding the MAD value.

Solution B – the lowest dilution of the Solution A serial dilutions to which the ERS solution was added. The final endotoxin concentration in the analyzed solution should be 2λ (positive control of the tested sample).

Solutions C – the series of ERS dilutions in Water for LAL-testing (positive control).

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

This analysis is carried out as described in the “Procedure description” section.

Table 4 — Experiment design, “Quantitative analysis”

Results and interpretation. A test should be considered reliable if the following conditions are fulfilled:

• for Solution D (negative control) – negative results are obtained in both replicates;
• for the Solutions C series (positive control) — the geometric mean value of the bacterial endotoxins concentration should be not less than 0.5λ and not more than 2λ;
• for Solution B (positive control of the tested sample) – positive results are obtained in two replicates;
• for the Solutions A series – the reaction end-point is a positive result obtained for the highest dilution of the tested medicinal product.

The respective dilution factor multiplied by the LAL-reagent sensitivity value (λ) is equal to the endotoxin concentration in Solution A obtained for this particular replicate.

The geometric mean value of the endotoxin concentration is calculated as described in the “Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity ” section.

If negative results are obtained for all replicates of the Solutions A series, the bacterial endotoxins concentration in the tested medicinal product is below the LAL-reagent sensitivity value multiplied by the lowest dilution factor. If positive results are obtained for all replicates of the Solutions A series, the bacterial endotoxins concentration in the tested medicinal product is above the LAL-reagent sensitivity value multiplied by the highest dilution factor.

A medicinal product has passed the test if the mean bacterial endotoxins content value produced by the test is below the Maximum Content of Bacterial Endotoxins value specified in the Pharmacopoeia Monograph.

PHOTOMETRIC METHODS (Methods C, D, E, and F)

TURBIDIMETRIC METHODS (C and F)

Turbidimetric methods are a variant of photometric methods based on measurement of the turbidity of the reaction mixture. Depending on the principle underlying the test, this method may be conducted either as an endpoint turbidimetric test or a kinetic turbidimetric assay.

The endpoint turbidimetric test (Method F) is based on measurement of the turbidity of the reaction mixture at the end of the incubation period, which depends on the endotoxin concentration.

The kinetic turbidimetric assay (Method С) is based on determination of the turbidity development rate of the reaction mixture evaluated by the time required to achieve a target optical density value.

CHROMOGENIC METHODS (D and E)

Chromogenic methods are used to determine the amount of the chromophore released from a chromogenic substrate as a result of the reaction between endotoxins and the LAL reagent. Depending on the principle underlying the test, this method may be conducted either as an endpoint chromogenic test or a kinetic chromogenic assay.

The endpoint chromogenic test (Method E) is based on measurement of the colour intensity of the reaction mixture, which depends on the amount of the chromophore released at the end of the incubation period. The amount of the released chromophore depends on the endotoxin concentration.

During the kinetic chromogenic assay (Method D), the rate at which the colour of the reaction mixture develops is determined; it is evaluated by the time required to achieve a target reaction mixture optical density value.

This test is conducted at the incubation temperature recommended by the manufacturer of the LAL reagent (usually 37 ± 1 °С).

PREPARATORY TESTING

To demonstrate the accuracy and reliability of test results obtained with the turbidimetric or chromogenic method, preliminary tests should be carried out to make sure that the standard curve criteria are reliable and that the tested solution contains no factors interfering with the course of the reaction.

Any changes that can have an effect on results of this experiment require additional confirmation of the reliability and accuracy of this test.

This analysis should be carried out for each new LAL reagent batch.

To obtain a standard curve, not less than three different concentrations of the endotoxin should be prepared from the stock ERS solution in accordance with the recommendations of the LAL reagent’s manufacturer. The test should be performed with at least replicates, under the conditions recommended by the manufacturer of the LAL reagent (volume ratios, incubation time, temperature, pH value, etc.).

If the procedure of a kinetic method necessitates a standard curve with an ERS range exceeding 2 lg of the endotoxin concentration value for each measurement range change of an endotoxin concentration value lg, an ERS solution of the appropriate concentration should be included in the design of this experiment.

The absolute correlation coefficient |r| value for the examined endotoxin concentration range should be equal to or more than 0.980.

Interfering factors

The test may be performed on any medicinal product in any dilution not exceeding the MAD value.

Procedure description. Solutions A – D should be prepared as specified in Table 5. Solutions A, B, C, and D should be tested on at least two replicates, in accordance with the recommendations of the LAL reagent’s manufacturer (volumes and volume ratios of the tested medicinal product and the LAL reagent, incubation time, temperature, pH value, etc.).

Table 5 — Experiment design, “Interfering factors”

Solution А - the solution of the tested medicinal product in a dilution not exceeding the MAD value;

Solution В - the tested medicinal product in the selected dilution upon addition of the ERS. The final endotoxin concentration of the analyzed solution should be equal or close to the mean value for the ERS concentrations used to plot the standard curve (positive control of the tested sample);

Solutions С - the ERS solutions used to plot the standard curve, at the same concentrations that were used during the «Standard curve criteria reliability check » (positive control);

Solution D - Water for LAL testing (negative control).

– results obtained for the standard curve (Solution С) meet the reliability criteria established for the «Standard curve criteria reliability check» section;

– the result obtained for Solution D (negative control) does not exceed the value specified in the Instructions for Use of the LAL reagent used or is lower than the endotoxin concentration detected by the method used.

The experimental mean concentration of the added endotoxin is calculated by subtracting the mean endotoxin concentration of Solution А (if available) from the mean endotoxin concentration of Solution В (containing the added endotoxin).

The tested solution is considered to be demonstrated to contain no interfering factors if the measured concentration of the endotoxin added to the tested solution is 50 % to 200 % of the known concentration of the added endotoxin under the test conditions.

If the endotoxin concentration determined in the experiment lies outside of the established limits, a conclusion is made that the tested medicinal product contains factors interfering with the reaction. In this case, the test may be repeated at a higher dilution, up to the dilution equal to the MAD. Apart from higher dilutions of the tested medicinal product, the effects of interfering factors may be overcome by appropriate processing, such as filtration, neutralization, dialysis, or temperature processing. The method chosen to eliminate interfering factors should not decrease the concentration of bacterial endotoxins in the tested medicinal product, therefore the ERS solution of the known concentration should first be added to the tested solution before such processing, and afterwards the «Interfering factors» analysis should be repeated. If test results obtained after the selected type of processing are deemed satisfactory, the tested medicinal product may be analyzed for the content of bacterial endotoxins.

Test procedure

Procedure description. The test should be carried out in accordance with the procedure description included in the «Interfering factors» section.

Results . The endotoxin concentration should be determined for each replicate of Solution А using the standard curve obtained using the ERS serial dilutions (Solution С ).

Test results are considered reliable if the following conditions are fulfilled:

1. results obtained for the standard curve (Solutions С ) meet the reliability criteria established for the «Standard curve criteria reliability check» section;
2. the experimental concentration of the endotoxin added to Solution B after subtracting the endotoxin concentration value found for Solution А lies in the range of 50 % to 200 % of the known value;
3. the result obtained for Solution D (negative control) does not exceed the value specified in the Instructions for Use of the LAL reagent used or is lower than the endotoxin concentration detected by the method used.

Interpretation of results. A medicinal product passes the test if the experimental mean content of bacterial endotoxins found for the Solution А replicates (adjusted for the dilution and concentration of the tested medicinal product) is lower than the bacterial endotoxins content upper limit specified in the Pharmacopoeia Monograph.

В одно из царств живой природы входят одноклеточные живые организмы, выделенные в отдел Бактерии. Большинство их видов вырабатывают особые химические соединения - экзотоксины и эндотоксины. Их классификация, свойства и влияние на организм человека будут изучены в данной статье.

Что такое токсины

Вещества (в основном белковой или липополисахаридной природы), выделяемые в межклеточную жидкость после ее гибели - это бактериальные эндотоксины. Если живой прокариотический организм продуцирует ядовитые вещества в клетку хозяина, то в микробиологии такие соединения называют экзотоксинами. Они оказывают разрушающее действие на ткани и органы человека, а именно: инактивируют ферментативный аппарат на клеточном уровне, нарушают обмен веществ. Эндотоксин - это яд, оказывающий поражающее действие на живые клетки, причем концентрация его может быть очень малой. В микробиологии известно около 60 соединений, выделяемых бактериальными клетками. Рассмотрим их более подробно.

Липополисахаридная природа бактериальных ядов

Учеными установлено, что эндотоксин - это продукт расщепления внешней мембраны Он представляет собой комплекс, состоящий из сложного углевода и липида, взаимодействующий с конкретным видом клеточных рецепторов. Такое соединение состоит из трех частей: липида А, молекулы олигосахарида и антигена. Именно первый компонент, попадая в кровоток, вызывает наибольший повреждающий эффект, сопровождаемый всеми признаками тяжелого отравления: диспептическими явлениями, гипертермией, поражениями центральной нервной системы. Заражение крови эндотоксинами происходит настолько стремительно, что в организме развивается септический шок.

Еще один структурный элемент, входящий в эндотоксин - это олигосахарид, содержащий гептозу - C 7 H 14 O 7 . Поступая в кровяное русло, центральный дисахарид также может вызывать интоксикацию организма, но в более легкой форме, чем случае попадания в кровь липида А.

Последствия влияния эндотоксинов на организм человека

Наиболее распространенными последствиями действия бактериальных ядов на клетки являются тромбогеморрагический синдром и септический шок. Первый вид патологии возникает вследствие поступления в кровь веществ - токсинов, снижающих ее свертываемость. Это приводит к многочисленным повреждениям органов, состоящих из соединительной ткани - паренхимы, таких, например, как легкие, печень, почки. В их паренхиме происходят множественные кровоизлияния, а в тяжелых случаях - кровотечения. Другой вид патологии, возникающий в результате действий бактериальных ядов - это септический шок. Он приводит к нарушениям крово- и лимфообращения, последствиями которого являются нарушения транспортировки кислорода и питательных веществ к жизненно важным органам и тканям: головному мозгу, легким, почкам, печени.

У человека резко нарастают угрожающие для жизни симптомы, такие как стремительное падение кровяного давления, гипертермия и быстроразвивающаяся острая сердечно-сосудистая недостаточность. Срочное медицинское вмешательство (проведение гормональной и антибиотикотерапии) купирует действие эндотоксина и быстро выводит его из организма.

Отличительные особенности экзотоксинов

Прежде чем выяснить специфику этого вида бактериальных ядов, напомним, что эндотоксин - это один из компонентов лизата клеточной стенки погибшей грамотрицательной бактерии. Экзотоксины синтезируются живыми как грамположительными, так и грамотрицательными. С точки зрения химического строения, они являются исключительно белками с небольшой молекулярной массой. Можно сказать, что основные клинические проявления, возникающие в процессе инфекционных болезней, вызваны именно поражающим действием экзотоксинов, которые образуются вследствие метаболизма самой бактерии.

Микробиологическими исследованиями доказана более высокая вида бактериальных ядов, по сравнению с эндотоксинами. Возбудители столбняка, коклюша, дифтерии вырабатывают ядовитые вещества белковой природы. Они обладают термолабильностью и разрушаются при нагревании в диапазоне от 70 до 95 градусов Цельсия в течение 12-25 минут.

Виды экзотоксинов

Классификация такого типа бактериальных ядов построена по принципу их влияния на структуры клетки. Например, различают мембранотоксины, они разрушают оболочку клетки хозяина или нарушают диффузию и ионов, проходящих через мембранный бислой. Также существуют цитотоксины. Это яды, действующие на гиалоплазму клетки и нарушающие реакции ассимиляции и диссимиляции, протекающие в клеточном метаболизме. Другие соединения - яды «работают», как ферменты, например, гиалуронидаза (нейроминидаза). Они подавляют работу иммунной системы человека, то есть инактивируют выработку В лимфоцитов, моноцитов и макрофагов в лимфатических узлах. Так протеазы разрушают защитные антитела, а лецитиназа расщепляет лецитин, входящий в состав нервных волокон. Это приводит к нарушению проведения биоимпульсов, и, как следствие, к снижению иннервации органов и тканей.

Цитотоксины могут действовать как детергенты, при этом происходит разрушение целостности липидного слоя мембраны клетки хозяина. Более того, они способны разрушать, как отдельные клетки организма, так и их ассоциаты - ткани, вызывая образование биогенных аминов, являющихся продуктами метаболических реакций и проявляющими токсические свойства.

Механизм действия бактериальных ядов

Микробиологическими исследованиями установлено, что эндотоксин - это комплексная структура, содержащая 2 молекулярных центра. Первый прикрепляет ядовитое вещество к специфическому рецептору клетки, а второй, расщепляя её мембрану, попадает непосредственно в гиалоплазму клетки. В ней токсин блокирует реакции обмена веществ: биосинтез белков, происходящий в рибосомах, синтез молекул АТФ, осуществляемый митохондриями, репликацию нуклеиновых кислот. Высокая вирулентность бактериальных пептидов, с точки зрения химического строения их молекул, объясняется тем, что некоторые локусы токсина маскируются под пространственную структуру веществ в клетке, таких как нейромедиаторов, гормонов и ферментов. Это позволяет токсину «обходить систему клеточной защиты» и стремительно проникать в её цитоплазму. Таким образом, клетка оказывается безоружной перед бактериальной инфекцией, так как теряет способность к образованию собственных защитных веществ: интерферона, гамма-глобулинов, антител. Нужно отметить, что свойства эндотоксинов и экзотоксинов схожи в том, что оба вида бактериальных ядов воздействуют на конкретные клетки организма, то есть обладают высокой специфичностью.

Эндотоксины эндотоксины

комплексы липополисахаридов с белками клеточных стенок грамотрицательных бактерий , обладающие свойствами ядов. Имеют антигенные свойства, идентичные соматическим антигенам целой клетки (О–антигены). В отличие от экзотоксинов термостабильны. Выделены из всех патогенных грамотрицательных бактерий (Salmonella, Vibrio cholerae, Shigella и др.); на этом основании в мед. микробиол. называются энтеротоксинами. Обладают пирогенностью (вызывают повышение температуры тела) и токсичностью; первое свойство определяется липополисахаридной фракцией Э., второе – белковой. Пирогенность и токсичность Э. неспецифичны и, как считается, играют лишь вспомогательную роль в патогенезе возбудителя заболевания.

(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)

Эндотоксины

токсические субстанции, входящие в структуру бактерий (обычно в клеточную стенку) и высвобождающиеся из них после лизиса бактерий. Чаще это название применяют по отношению к липополисахаридам клеточной стенки грам- бактерий с м.м. 100 - 900 тыс., к-рые с белками и липидами образуют сложный макромолекулярный комплекс. Независимо от видовой принадлежности Э имеют сходную структуру и хим состав, обладают высокой и многообразной активностью В экспериментальных и клин, условиях Э вызывают лихорадку, лейкоцитоз с быстрым переходом в лейкопению, гипогликемию, понижение кровяного давления и шок, феномен Санарелли -Швартцманна, некроз опухоли, повышают активность неспецифических факторов иммунитета, обладают адъювантной и высокой антигенной активностью. Токсическое действие Э проявляется сразу после введения, выражено в меньшей степени, чем у экзотоксинов, малоспецифично, неразрывно связано с антигенностью: утрата токсичности приводит к утрате антигенности. Механизм действия Э. связан с активированием фосфорилазы клеточной мембраны и последующим высвобождением арахидоновой кислоты, а также усилением синтеза простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Эти медиаторы воспаления способствуют агрегации лейкоцитов и тромбоцитов, оказывают воздействие на тонус и проницаемость сосудов. См. Токсины бактериальные .

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "эндотоксины" в других словарях:

Бактериальные токсические вещества, которые представляют собой структурные компоненты определённых бактерий и высвобождаются только при лизисе (распаде) бактериальной клетки. Это отличает эндотоксины от экзотоксинов, растворимых соединений,… … Википедия

ЭНДОТОКСИНЫ - (от эндо... и токсины), бактериальные токсины, токсические вещества, образующиеся внутри микроорганизмов (особенно грамотрицательных бактерий). Прочно связаны с клеточной структурой и освобождаются при распаде клеток или их разрушении в… … Экологический словарь

ЭНДОТОКСИНЫ - ЭНДОТОКСИНЫ, см. Токсины. 3HflO0TA/lbMHT(endophthalmitis), по Фуксу, воспаление радужной оболочки и цилиарного тела, иридоциклит, или реже иридо хориоидит, после прободающих ранений глаза (первичный Э.) или при проникновении инфекции через… … Большая медицинская энциклопедия

эндотоксины - Токсичные вещества, прочно связанные с клеточными структурами бактерий и высвобождающиеся при распаде клеток или их разрушении в результате воздействия физических или химических факторов. См. также Toxins (токсины). [Англо русский глоссарий… … Справочник технического переводчика

- (см. эндо...) яды (токсины), освобождающиеся при распаде микробов, их гибели ср. экзотоксины). Новый словарь иностранных слов. by EdwART, 2009. эндотоксины [см. эндо… + токсины] – бактерийные яды, освобождающиеся при распаде бактерий Большой… … Словарь иностранных слов русского языка

Похожие статьи